串聯(lián)質譜法同時測定人體尿液中4種有機磷農藥代謝物

1 引 言 
　　繼有機氯農藥被禁用后，有機磷類農藥（Organophosphorus pesticides，OPs）成為國內目前農業(yè)生產上應用廣泛、使用量大的農藥[1]。OPs具有易降解、殺蟲效果好、抗性不顯著、殘效期較短的特點，除廣泛應用于農業(yè)生產中[2]，還常作為除草劑應用于公園、綠地等公共場所。 
　　OPs進入人體后代謝迅速，蓄積現(xiàn)象不明顯。OPs由于其結構的相似性，進入體內后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代謝產物中的1種或幾種，在較短的時間內隨尿排出[3]，主要有機磷農藥代謝產物見表1。除6種二烷基磷酸酯外，OPs還會產生特殊代謝產物，每種特殊代謝產物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產生，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代謝產物為3，5，6三氯2吡啶醇（3，5，6TCP），對硫磷、甲基對硫磷的特殊代謝產物為對硝基酚，馬拉硫磷的特殊代謝產物為馬拉硫磷二羥基酸[4]。 
　　近年來，農藥暴露對人體健康的影響受到廣泛關注[6～9]。根據(jù)OPs代謝較快的特點，檢測人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評估人體的OPs暴露水平。檢測尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質譜聯(lián)用法[10～12]、氣相色譜串聯(lián)質譜法[13～15]、液相色譜串聯(lián)質譜法[16～18]。液相色譜串聯(lián)質譜法前處理較為簡單，但實際應用中靈敏度不高，且基質效應造成的離子抑制比較普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12，15～17]、固相萃取[13，20]、凍干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯(lián)質譜技術建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產物及1種特殊代謝產物的高靈敏檢測方法，避免了液/液萃取使用yi醚對實驗室造成的安全隱患，實驗時間大幅縮短，凈化效率優(yōu)于凍干法。本方法為有機磷農藥的人體內暴露研究提供了良好的技術支撐。 
　　2 實驗部分 
　　2.1 儀器與試劑 
　　Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R210旋轉蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司，中國）；Centrifuge C5804離心機、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）；MilliQ純水器（美國Mimpore公司）。 
　　乙腈、乙酸乙酯、甲苯（分析純，南京化學試劑有限公司）；甲醇、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，>97.0%，美國Aldrich公司）。 其它試劑均為國產分析純。 
　　Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL），均購自美國Waters公司。 
　　固相萃取DAPs：吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL濃HCl，渦旋1 min，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化），通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中。上樣后，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液置于10 mL具塞比色管中。 
　　液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH，使樣品pH≈7.0，加入2 g NaCl，渦旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V），渦旋3 min，6000 r/min離心5 min。上清液經過含適量無水Na2SO4的漏斗轉移至雞心瓶中，旋蒸濃縮至2 mL左右。 
　　用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中，40℃水浴中氮吹至*干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯，渦旋1 min，轉移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L內標DBP，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min。 
　　衍生化后的溶液冷卻至室溫，過0.22 μm有機相濾膜，供GCMS/MS分析。 
　　2.3 氣相色譜條件 
　　DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃，保持2 min；進樣量1.0 μL；不分流進樣，載氣：氦氣（99.999%），流量：1.0 mL/min，進樣器溫度： 250℃。 
　　2.4 質譜條件正離子模式的電噴霧電離ESI+，多反應離子監(jiān)測（MRM），TCP采用選擇離子檢測（SIM）， EI源轟擊能：70 eV，離子源溫度：180℃，傳輸線溫度：250℃，溶劑延遲時間：5.0 min，碰撞氣：高純氬氣，保留時間定性，內標法定量。其它質譜參數(shù)見表2。 
　　3 結果與討論 
　　3.1 基質的選擇 
　　選擇基質時，如采用人工合成尿液進行實驗，雖然本底較為干凈，干擾小，但人工尿液中不含蛋白質，與實際尿液有很大差距，不能有效反映人體實際尿液基質的復雜性。如采用單個個體尿液作為基質，有的個體存在較高的本底值，不適合測定方法的建立。因此，本實驗通過篩選不同個體的尿液，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實驗的基質。 
　　3.2 前處理條件優(yōu)化 
　　3.2.1 液/液萃取 文獻報道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本實驗首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶劑見表3，結果見圖2。結果表明，采取液/液萃取法提取DAPs時，同一提取方案對不同代謝物提取回收率差別較大，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求，TCP的液/液萃取回收率較高。由于TCP的pKa=7.5，近中性，故萃取時將溶液調至pH ≈7，確保萃取時TCP的存在形式為分子態(tài)[18]。 
　　3.2.2 固相萃取柱的選擇 
　　目前文獻所報道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法，固相萃取法的報道較少。本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對各代謝物的萃取效果，結果見圖3。 
　　Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣，可從各種基質中分離出多種酸性、堿性和中性化合物，但DMTP回收率過高，其它物質則過低。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱，適用于酸性物質， 具有高選擇性，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25， DMTP pKa=1.37， DEP pKa=1.37， DETP pKa=1.49），但本實驗發(fā)現(xiàn)其對DMP、DEP基本沒有保留，對DMTP、DETP雖有保留，但回收率非常不穩(wěn)定，不適用于從尿液中提取DAPs，而TCP的pKa近中性，不易被WAX柱吸附。 
　　Waters Oasis WCX柱對DMTP、DEP、DETP、TCP均有保留，且回收率較穩(wěn)定。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子。DAPs的pKa較低，呈酸性，實驗中采用強酸酸化并不會使DAPs分子解離，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對電子，吸引溶液中的氫質子，從而使DAPs分子質子化，帶正電荷，可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs，由于極性較大，正電性較弱，在WCX柱上基本無保留。WCX柱對除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故選其作為固相萃取柱，并對其洗脫條件進行優(yōu)化。 
　　3.2.3 洗脫條件的優(yōu)化 在洗脫條件的優(yōu)化中，分別考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果，結果見圖4。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收），高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩(wěn)定。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當，TCP基本無回收。隨著酸度增加，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液，回收率可以接受，且較為穩(wěn)定。 
　　3.3 固相萃取與液/液萃取的比較 
　　采用表3中方案4作為液/液萃取方法，與優(yōu)化過的固相萃取方法進行回收率的比較，結果見圖5。 
　　對于DMTP， DEP和DETP，固相萃取的回收率和穩(wěn)定性均高于液/液萃取。對于生物基質樣品分析，方法的穩(wěn)定性十分重要。液/液萃取提取TCP的回收率和穩(wěn)定性優(yōu)于固相萃取。用何種提取方法DMP，結果均不能令人滿意。終采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP，采用表3中方案4提取TCP。 
　　3.4 衍生化反應 
　　本實驗采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對目標化合物進行衍生化反應。目標代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應原理如圖6所示，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標代謝物分子中，取代分子中的活性氫。 
　　文獻[5，10，11，20，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對DAPs進行衍生化，衍生化反應需加入適量K2CO3。與采用PFBBr相比，MTBSTFA的衍生化反應時間較短（PFBBr衍生化反應需16 h[21]），不需要其它試劑參與，不必考慮其它試劑的用量對衍生化效率的影響。 
　　3.5 方法學驗證 
　　3.5.1 標準曲線及線性范圍 向尿樣中添加目標代謝物混合標準溶液，按2.2節(jié)中前處理方法進行提取、凈化，在優(yōu)化后的色譜及質譜條件下進樣，繪制工作曲線，記錄各待測物色譜峰面積（As）與內標色譜峰面積（Ar）。以各待測物與內標的峰面積比R （R= As/As）對濃度（C，mg/L）進行線性回歸，確定線性范圍及檢出限、定量限。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定。DMP在固相萃取柱上基本無保留，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關系數(shù)均在0.9923～0.9942之間，表明各代謝物在相應的濃度范圍內線性關系良好， 結果見表4。 
　　3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標準品，衍生化反應效率無法確定，整個樣品制備過程的回收率無法考察。本研究按2.2節(jié)方法同時處理加標與未加標的基質，未加標基質在衍生化前加入等量標準溶液，由兩者響應的比值計算回收率，設置低、中、高3個添加濃度，結果見表5。生物體液樣本基質較為復雜，分析前需要經過衍生化反應，處理步驟較多，回收率低于基質單一的樣品。3.5.3 基質效應 采用提取后添加法評定基質效應。按照2.2節(jié)方法處理尿液基質，衍生化前加入標準品溶液，進樣后所得峰面積記為A組峰面積；純溶劑衍生化前加入標準品溶液，進樣后所得峰面積記為B組峰面積。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察基質效應，4種代謝物的基質效應在60%～176%之間，故采用基質加標工作曲線消除基質效應的影響。 
　　3.6 氣相色譜質譜條件優(yōu)化 
　　根據(jù)目前已有文獻報道，本研究嘗試了不同的升溫程序。優(yōu)化后的色譜圖見圖7，各物質峰形良好，分離效果。 
　　代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7，運用Daughter Scan模式，進行子離子掃描，并對碰撞能量進行優(yōu)化，以達到較高的靈敏度。3，5，6TCP在正離子檢測方式下，基峰為m/z 256，運用Daughter Scan模式，進行子離子掃描， 結果并未發(fā)現(xiàn)響應穩(wěn)定且較強的碎片峰，這與3，5，6TCP的環(huán)狀結構特點較為一致。 
　　3.7 樣品分析 
　　采集居住在農藥廠附近居民的晨尿樣品40份，其中兒童尿液樣品20份，成人尿液樣品20份，按2.2節(jié)中的實驗方法進行處理，測定結果見表6。 
　　結果表明，成人尿液樣品DMTP， DEP， DETP， TCP檢出率分別為85%， 90%， 90%， 45%，兒童尿液樣品分別為35%， 75%， 65%， 60%。成人尿液中非特異性代謝物DMTP， DEP， DETP的檢出率均高于兒童，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童。結果表明，居住在農藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機磷農藥內暴露，呼吸可能是造成有機磷農藥內暴露的重要途徑。以尿液中代謝物作為評估有機磷農藥暴露程度的指標，成人的暴露量大于兒童，這是由于成人的呼吸量較大， 且對農藥的代謝能力較強。不同成人與兒童尿液中有機磷代謝物檢出的差異與其住所位置、膳食結構等都有密切的關系。 
　　4 結 論 
　　建立了固相萃取氣相色譜串聯(lián)質譜同時分析制尿液中4種OPs代謝物的方法，定量檢測了人體尿液中4種代謝物含量。本研究采用WCX固相萃取柱，與液/液萃取相比，耗費的有機溶劑更少，耗時更短，適合于大批量樣品的前處理，為研究人群中低劑量OPs農藥暴露情況提供了方法學基礎。