固相萃取—液相色譜法測(cè)定大豆油中維生素K1含量

維生素K為人體必需的脂溶性維生素，其中人體維生素K1主要來(lái)源于綠葉蔬菜（如菠菜、甘藍(lán)、萵苣等）、大豆及其制品。隨著對(duì)維生素K生理功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)凝血、參與骨骼代謝、維持心血管健康等諸多功能。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)食物中維生素K1分析測(cè)定日益關(guān)注。在食品中維生素K1檢測(cè)方法中，液相色譜法（HPLC）因具有靈敏、精密度高、分離效果好、樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛應(yīng)用。我國(guó)已制定蔬菜和乳制品中維生素K1含量的測(cè)定方法，但由于缺乏良好的提取和分析方法，國(guó)內(nèi)尚無(wú)測(cè)定大豆油中維生素K1的標(biāo)準(zhǔn)方法，有關(guān)大豆及大豆制品中維生素K1的研究報(bào)道也較少。近年來(lái)，在色譜分析樣品前處理中，固相萃?。⊿olid Phase Extraction， SPE）成為重要的方法之一，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)研究者使用SPE進(jìn)行色譜分析食品樣品的前處理。測(cè)定大豆油中維生素K1含量的關(guān)鍵是如何進(jìn)行分離提取，去除各種干擾物質(zhì)并避免維生素K1破壞。本研究選用SPE硅膠柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，分離提取大豆油中的維生素K1，運(yùn)用靈敏、的液相色譜法測(cè)定樣品中維生素K1。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

UV1201紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、AS1201自動(dòng)進(jìn)樣器、RO1201溶劑管理器、P1201高壓恒流泵、EC2006色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（大連依利特公司）；Laborota 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵；Eppendorf AG5305隔膜真空泵；SC-2546型低速離心機(jī)；G-560E漩渦振蕩器；SPE硅膠柱（6 mL，1 g）。

正己烷（色譜純）、甲醇（色譜純）、維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；yi醚（分析純）、正己烷（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：V（甲醇）︰V（正己烷）=98︰2；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.5 mL/min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（至0.001 g），用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中搖勻，得1 mg/mL維生素K1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 樣品提取與凈化 所有操作在避光室內(nèi)微弱黃光燈下進(jìn)行。

取0.1 g油樣（至0.001 g）溶于5 mL正己烷，劇烈震蕩5 min，離心5 min（3 000 r/min），取4.5 mL上清液，待凈化。

將SPE硅膠柱（6 mL，1 g，Agilent）分別用8 mL正己烷︰yi醚=97︰3和8 mL正己烷將SPE柱活化后，提取液以1.0 mL/min流速過(guò)柱；用8 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗小柱，后分5次加入20 mL正己烷︰yi醚=97︰3溶液洗脫，收集洗脫液后濃縮吹干；用5 mL正己烷溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至試管低溫濃縮30 min，加1 mL正己烷定容離心5 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.2.4 測(cè)定方法 吸取上述樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別注入液相色譜儀，測(cè)得色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中的維生素K1含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方法優(yōu)化

脂溶性維生素K1在大豆油中含量豐富，如何避免維生素K1破壞并去除干擾物質(zhì)是分離提取的關(guān)鍵。GB 5413.10-2010將嬰幼兒乳制品中的脂肪酶解皂化后提取維生素K1，但維生素K1遇堿易分解，皂化處理使測(cè)定結(jié)果降低。趙丹霞等采用溶劑萃取提取植物油中的維生素K1，方法簡(jiǎn)單，但是樣品不經(jīng)凈化或凈化不*，共同洗脫下的干擾物質(zhì)如維生素A、維生素D、維生素E會(huì)影響HPLC的分離效果。固相萃取法比溶劑萃取法使用的溶劑更少，操作過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)單，提取和凈化同步完成。GB/T5009.158-2003測(cè)定蔬菜中維生素K1選用氧化鋁做色譜柱，避免使用氧化鋁可能造成的維生素K1分解現(xiàn)象。對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理前要先用失活的磷酸鹽處理氧化鋁，前處理時(shí)間長(zhǎng)且處理過(guò)程復(fù)雜。Kamao等使用SPE硅膠柱凈化處理油脂類食品，再進(jìn)行HPLC分析，SPE硅膠柱體積小，對(duì)樣品的富集和凈化效果好。因此，對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)后采用硅膠柱固相萃取法凈化大豆油樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取與凈化后的HPLC分析圖譜分別見(jiàn)圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，處理后的樣品分析圖譜基線穩(wěn)定，保留時(shí)間附近的雜質(zhì)被有效去除，干擾較少。同時(shí)，對(duì)維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示回收率較高，詳見(jiàn)表1。

2.2 樣本量大小確定及加樣回收率試驗(yàn)

本研究采用SPE硅膠柱（6 mL，1 g，Agilent）柱內(nèi)硅膠填料容量較小。由于大豆油取樣量過(guò)大，在載樣過(guò)程中可能有部分維生素K1不能被吸附，直接影響層析效果，造成回收率偏低。參考上樣體積對(duì)維生素K1回收的影響，通過(guò)比較不同的上樣體積，終確定SPE硅膠柱的佳上樣質(zhì)量為0.1 g。此時(shí)分離效果較好，樣品中維生素K1的回收率也較好，結(jié)果可靠（詳見(jiàn)表2）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

吸取維生素K1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL，用分析純正己烷溶解定容至5 mL，混勻，得到濃度為20 μg/mL的稀釋液。再分取一定體積用正己烷稀釋溶解定容，分別配制成含維生素K1 0.125，0.25，0.50，2.50，5.00，

10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，上機(jī)測(cè)定，以維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，維生素K1在0～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.999）。

2.4 低檢測(cè)限

將標(biāo)準(zhǔn)工作液依次稀釋，以10倍儀器響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計(jì)算得到儀器的檢測(cè)限為0.062 5 μg/mL。

2.5 重復(fù)性測(cè)定

在較短的間隔時(shí)間內(nèi)，取同一份維生素K1標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行6次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。此次試驗(yàn)的變異系數(shù)為3%，由此可見(jiàn)試驗(yàn)重復(fù)性較好。

2.6 溶液穩(wěn)定性測(cè)定

取同一個(gè)待測(cè)樣品分別放置在避光和室內(nèi)室溫暗處（22～25 ℃）0，2，4，6，8 h，取待測(cè)樣品溶液20 μL在同一色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，測(cè)定樣品中維生素K1含量的穩(wěn)定性較好。

2.7 大豆油樣品中維生素K1含量測(cè)定

測(cè)定29種大豆油中的生素K1平均含量，結(jié)果顯示未檢出至215 μg/100 g，平均140.92±33.99 μg/100 g。由于地理環(huán)境、植物種類存在差異，因此需要對(duì)測(cè)定結(jié)果做進(jìn)一步研究。未檢出的樣品中可能不含維生素K1或含量較低，未達(dá)到本方法的低檢出限。

3 結(jié)論與討論

本方法建立了固相萃取-液相色譜法測(cè)定大豆油中維生素K1的方法，改變了樣品的前處理方法，避免使用皂化處理，減少了維生素K1的損失。利用固相萃取方法凈化處理樣品，能有效地去除樣品中的干擾物質(zhì)。采用富集和凈化效果好的小體積硅膠柱，所獲結(jié)果可靠、重復(fù)性良好，適用于測(cè)定不同種類的大豆油中維生素K1的含量。