固相萃取—液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定牛奶中9種性激素殘留

0 引 言 
性激素（sex hormones）是一類由動物體性腺所產(chǎn)生或人工合成的低分子量、親脂性、具有生物活性的類固醇類物質(zhì)[1]。它是甾體同化激素中主要組成部分，這些物質(zhì)具有蛋白質(zhì)同化作用，通過增強食欲、抑制發(fā)情和提高飼料轉(zhuǎn)化率，達到大幅度提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的目的[2]。畜牧業(yè)濫用這些類固醇類激素，導致這些激素殘留終通過食物鏈進入人體，已成為性的食品安全問題[3]。有研究指出激素殘留人體有“三致”作用，主要是導致體內(nèi)脂肪堆積、兒童性早熟以及自身激素分泌失調(diào)，攝入可造成內(nèi)分泌系統(tǒng)相關腫瘤、生長發(fā)育障礙、出生缺陷、生育缺陷 等，給人體健康帶來不良影響[4-5]。 
關于牛奶中的性激素殘留測定方法有很多，目前國內(nèi)外普遍的檢測方法為儀器法和免疫法。儀器分析法主要有液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC/MS）[6]、液相-質(zhì)譜法（UPLC/MS）[7-8]和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）[9]，隨著酶聯(lián)免疫技術的迅速推廣，被企業(yè)等普遍采用。樣品前處理方式也較多，如固相萃取、分散固相萃取[9]、中空纖維棒液液萃取[10]等。要達到高靈敏度和檢出限，就需要采用液質(zhì)聯(lián)用的方法；因此，近年來采用液質(zhì)聯(lián)用法測定牛奶中激素含量成為了研究熱點。調(diào)查表明牛乳和初乳中有類固醇激素[11]，但目前關于牛奶奶源的激素情況普查較少。本文在這些研究基礎上，選取了固相萃取柱凈化的方法，建立了液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC/MS）測定牛奶中常見的9種性激素殘留的方法，并從奶源入手，應用所建立的方法檢測了四川某牧場的原料奶檢測了其性激素殘留狀況。1 材料與方法 
1.1 材料與試劑 
標準品（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于97.5%。甲酸（色譜級），天津市科密歐化學試劑有限公司；氨水（優(yōu)級純），成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈（色譜級），美國Tedia公司；純水；其他試劑均為分析純。 
1.2 儀器與設備 
液相色譜儀（Agilent 1260）-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent 6410）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg 6 mL）；DIKMA ProElut C18固相萃取柱（500 mg 6 mL）；Agilent Bond Elut PLEXA固相萃取柱（500 mg 6 mL）；離心機（蜀科LG10-2.4A）；旋渦混勻器（Ika MS3）；電子天平（龍騰ESJ-200-4B）；12位水浴型氮吹儀（華盛譜信QF-3800）；聲波清洗器（昆山市聲儀器KQ-5200E）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（亞榮生化儀器RE-52AA）。 
1.3 標準液配制 
分別稱取每種性激素標準品10.0 mg，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的母液，于-20 ℃冰箱避光保存，放置時間不宜過半年。再用甲醇將其稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的中間儲備液。使用時，根據(jù)實際操作要求，用甲醇稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同濃度的標準工作液。 
1.4 儀器參數(shù) 
1.4.1 色譜條件 
色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱溫：40 ℃，進樣體積：10 μL，流量：0.3 mL/min。按表1和表2進行梯度洗脫。 
1.4.2 質(zhì)譜條件 
多反應監(jiān)測（MRM）模式，電噴霧離子源（ESI）；干燥氣流量：10 mL/min；干燥氣溫度：350 ℃；霧化器壓力：35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細管電壓：正模式4 000 V，負模式3 500 V；其余質(zhì)譜參數(shù)見表3。 
1.5 樣品處理 
1.5.1 提 取 
稱取5.0 g的牛奶試樣，置于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，旋渦混勻1 min，聲振蕩15 min，于7 000 r/min條件下離心15 min，將上清液置于雞心瓶中，加入20 mL正己烷萃取兩次，去掉正己烷層后于45 ℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用5 mL甲醇和20 mL水充分溶解，溶液用于固相萃取。 
1.5.2 凈 化 
Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化后，將試樣溶液過柱，再用5 mL水淋洗，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，加入1 mL甲醇，旋渦振蕩1 min，過0.22 μm濾膜，濾液置于進樣瓶中，待上機進行LC/MS分析。 
2 結(jié)果與分析 
2.1 提取液的選擇 
常用提取劑有水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等[12-13]，近年來研究以甲醇和乙腈為提取劑*[14]。本實驗分別對比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯提取后乳化現(xiàn)象比較嚴重，7 000 r/min離心15 min后仍無明顯效果；乙腈和甲醇提取的峰面積無顯著差異，綜合考慮到試劑毒性等因素，終選擇甲醇作為提取液。 
2.2 流動相的選擇 
質(zhì)譜測定性激素常用流動相為甲醇和水或者乙腈和水，本文中除雌激素外的其他性激素的流動相為甲醇和水，由于甲醇為流動相各激素的響應信號要高于乙腈，故選擇甲醇和水。其中添加甲酸的目的是有利于目標物質(zhì)的離子化，本文對比了不同體積分數(shù)的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%），從各激素的響應值得出適的甲酸溶液的體積分數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn)，從0.05%～0.1%時，各激素的響應值逐漸增加，從0.1%～0.3%時，各激素的響應值不斷降低，所以當體積分數(shù)為0.1%時，目標化合物的響應值適。檢測雌激素的流動相為乙腈和水（0.1%的氨水），實驗表明，0.1%氨水有效地提高了雌激素的質(zhì)譜響應。 
2.3 固相萃取柱的選擇 
本實驗選用固相萃?。⊿PE）方式凈化樣品，實驗中選擇了Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut C18及Agilent Bond Elut PLEXA 3種SPE小柱，通過加標回收率來選擇合適的小柱，加標濃度為100 μg/L，結(jié)果3種固相萃取柱對于9種性激素的加標回收率范圍分別為70.4%～96%，30%～60.2%和34.5%～71.8%。因此，終選擇Waters Oasis HLB小柱。 
2.4 加標回收率和檢出限（LODs）線性關系、方法回收率與精密度 
按上述處理方法，配制各激素系列的混標溶液，質(zhì)量濃度為2.5～500 μg/L，以定量離子的峰面積為縱坐標，以相對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出線性回歸方程，相關系數(shù)均大于0.994 4，表明各激素在質(zhì)量濃度為2.5～500 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，如表4所示。 
取牛奶樣品做回收率實驗，在5.0 g牛奶中添加不同濃度的混合標準溶液，性激素添加水平為50， 
100 μg/kg，每個添加水平平行檢測6次（n=6）。按上述實驗過程處理后，得出各激素的回收率和變異系數(shù)（CV），結(jié)果如表5所示。 
2.5 樣品分析 
用建立的方法對四川某牧場隨機采集的牛奶樣品進行檢測，隨機選取健康無抗生素使用、無激素類藥物使用且處在不同泌乳時期的荷斯坦奶牛90頭，每頭牛分別采集50 mL，跟蹤采集10頭牛分娩后1～7 d的初乳。采集到的牛奶樣品-20 ℃密封保存，檢測時，解凍即可。檢測結(jié)果如表6所示。 由表6可以看出，牛初乳中激素種類較多，且隨天數(shù)的增加有下降趨勢，其中3種內(nèi)源性激素：17α-雌二醇、雌酮、雌三醇到第3天以后均未檢出，丙酸睪酮第4天后也未檢出。初乳中激素種類較多且含量較高，這主要來源于奶牛的人工授精以及自身ren娠期的分泌。 
檢測發(fā)現(xiàn)常乳（共90頭：牛只胎次以1次為主，涵蓋1～4胎次；其中牛只泌乳期涵蓋1～10個月）中含有3種性激素，3種激素分別為醋酸甲羥孕酮、甲睪酮和諾龍。醋酸甲羥孕酮主要集中在泌乳初期的第1個月，其中該激素含量的變化范圍為0.25～1.55 μg/kg。甲睪酮主要集中在泌乳初期第1～2月，該激素含量的變化范圍為0.22～3.43 μg/kg。諾龍集中在泌乳初期第1個月，該激素含量變化范圍是0.56～3.74 μg/kg。由此可見，牛奶中這3種激素的降解速度較慢。 
初乳測定結(jié)果與范志影等[15]關于內(nèi)源性激素的報道一致，雌酮：3220 ng/kg，17α-雌二醇：727 ng/kg，雌三醇：167 ng/kg。對常乳的報道較少，曹勁松等[16]研究表明常乳中存在一定含量的雌激素，其中雌三醇為9～31 pg/mL。目前測定均為市售牛奶樣品，張艷等[17]研究檢測出孕酮及17α-雌二醇，本研究中常乳經(jīng)檢測并未檢出此類激素。 
3 結(jié)束語 
本實驗建立了固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中9 種性激素多殘留的方法。其中3種雌激素和其余性激素分別采用不同離子模式均得到較好分離。應用建立的方法對四川某牧場牛初乳以及常乳進行檢測，檢測到3種性激素，并主要存在于泌乳期前2個月，結(jié)果表明并未檢測出常見的內(nèi)源性雌激素，可能是方法檢出限略高的原因[18]。由于牛奶是激素攝入的主要來源之一，因此加強對牛奶中激素的檢測十分必要。經(jīng)驗證該方法操作簡單、度高，可作為牛奶中性激素測定的檢測方法，也可為其他乳制品中性激素的檢測提供方法參考。