固相微萃取技術(shù)在白蟻表皮碳?xì)浠衔锓治鲋械膽?yīng)用

白蟻是上*的檢疫性有害生物，其中許多種類(lèi)對(duì)農(nóng)、林、水利、交通、化工、房屋建筑等方面危害巨大，涉及到國(guó)計(jì)民生的幾乎各個(gè)方面。但在分類(lèi)鑒定上由于白蟻的外部形態(tài)相似，體壁柔軟，骨化程度低，可分類(lèi)的性狀較少。且白蟻的繁殖隔離機(jī)制主要不是通過(guò) 器官的結(jié)構(gòu)來(lái)完成的，無(wú)論雌雄有翅繁殖成蟲(chóng)， 均為幾塊簡(jiǎn)單的骨片，分類(lèi)鑒定時(shí)無(wú)法采用 的特征。因而目前對(duì)截獲白蟻種類(lèi)的鑒定主要根據(jù)兵蟻的形態(tài)，但兵蟻的形態(tài)有較大變異，更有一些類(lèi)群缺乏兵蟻，利用兵蟻分類(lèi)具有一定局限性，且不少白蟻的種類(lèi)由于地域的差異形態(tài)有一定的趨同現(xiàn)象，這都給白蟻的分類(lèi)帶來(lái)了較大的困難。 
　　國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，昆蟲(chóng)表皮碳?xì)浠衔锏慕M分和含量在種之間存在差異，即使在親緣關(guān)系很近的種之間也有明顯差異。由于昆蟲(chóng)表皮碳?xì)浠衔锝M成具有一定的物種特異性和地理種群特異性，已在蜜蜂、螞蟻、舌蠅、蟑螂、白蟻、棉鈴蟲(chóng)的分類(lèi)中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。白蟻表皮碳?xì)浠衔锲鹬喾N作用，影響到其取食、交配、蟻巢的構(gòu)建以及其種群之間的防御。它是表皮蠟層中一類(lèi)長(zhǎng)鏈烴類(lèi)，是蠟層的主要成分。是比較重要的信息物質(zhì)，可以有效地抵制水分的散失和微生物的入侵。在白蟻表皮碳?xì)浠衔锏奶崛》椒ㄖ?，傳統(tǒng)的正己烷提取法存在操作復(fù)雜、提取時(shí)間較難掌握等缺陷。 
　　本研究的目的為利用固相微萃取裝置探索其在白蟻表皮碳?xì)浠衔锾崛》治錾系目尚行?，為白蟻鑒定工作鑒定提供一定的基礎(chǔ)。 
　　 
　　1　材料與方法 
　　 
　　1.1供試蟲(chóng)源 
　　中國(guó)臺(tái)灣乳白蟻Coptotermes formosanus Shiraki由無(wú)錫市白蟻防治所室內(nèi)飼蟲(chóng)，試蟲(chóng)均為成熟健壯工蟻，試蟲(chóng)在(25±1)℃饑餓24 h后備用。 
　　 
　　1.2試劑與儀器 
　　手動(dòng)SPME手柄，3種萃取頭100 ttmPDMS萃取頭、75 μmPDMS／DVB萃取頭和85 gmPA苯取頭(購(gòu)置美國(guó)Supleeo公司)。 
　　Finnigan Trace GC Ultra型氣相色譜儀(意大利Thermo Finnigan公司)，F(xiàn)innigan Trace DSO型質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Electron公司)。色譜柱HP-5MS(30 m×250μm i.d，×0.25μm)(美國(guó)Agilent公司)。 
　　 
　　1.3儀器分析條件 
　　進(jìn)樣口溫度為250℃，程序升溫為80％保持1 min，16％／min升溫到280％保持10 min。載氣為He氣，流速為0.5 mL／min，電子俘獲檢測(cè)器溫度(ECD)溫度為280℃，萃取頭在進(jìn)樣口的停留時(shí)間為10 min，隨后立即拔出，電子電離(EI)：70 ev。質(zhì)譜掃描范圍為m/x 40～650。 
　　 
　　1.4樣品制備方法 
　　取50頭白蟻兵蟻放于2 mL的萃取瓶中，在蟲(chóng)體上方加入金屬網(wǎng)對(duì)白蟻進(jìn)行隔離，同時(shí)插入萃取頭進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為30、60、90min以選出佳萃取時(shí)間。萃取完成后退去萃取頭，隨即進(jìn)入氣譜進(jìn)樣口中進(jìn)行解析，每次解析時(shí)間為10 min。萃取頭每使用1次后，都要在250℃的進(jìn)樣口中解吸附60 min。萃取頭和萃取時(shí)間確定后，取同種白蟻進(jìn)行萃取，重復(fù)4次。 
　　 
　　 
　　 
　　 
　　1.5數(shù)據(jù)分析 
　　所有數(shù)據(jù)利用Statistica 6.O分析差異顯著性。 
　　 
　　2　結(jié)果與分析 
　　 
　　2.1萃取頭的選擇 
　　將3種萃取頭用于萃取白蟻表皮碳?xì)浠衔锝Y(jié)果表明，85μmPA的萃取效率比100μmPDMS、75 tmaPDMS／dvb要低。PDMS與PDMS／dvb之間沒(méi)有明顯差異(圖1)，但PDMS比PDMS／dvb萃取頭的抗逆性能以及重復(fù)性要好。固而在以下實(shí)驗(yàn)中采取了用PDMS萃取的方法。 
　　 
　　2.2萃取溫度對(duì)萃取效果的影響 
　　萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響見(jiàn)圖2，本實(shí)驗(yàn)選取了3個(gè)溫度作為萃取的實(shí)驗(yàn)溫度，分別為30、60和90℃，從圖中可以看出隨著溫度的升高，萃取的峰面積越大，90℃時(shí)峰面積大，但與60℃時(shí)的峰面積之間沒(méi)有差異性，但考慮到溫度太高可能會(huì)導(dǎo)致白蟻體表物質(zhì)變性，故而在本次實(shí)驗(yàn)中選取60℃為佳萃取溫度。 
　　 
　　2.3萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響 
　　由圖3的溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)不同時(shí)間內(nèi)均能萃取到碳?xì)浠衔?，但隨著溫度的升高萃取的物質(zhì)的量逐漸增大(圖3)。其中80min時(shí)的峰面積值高，其次為60 min，但兩者之間差異不顯著。60 min、80 min 2個(gè)萃取時(shí)間與其他3種萃取時(shí)間之間差異顯著。故而在以下的實(shí)驗(yàn)中選取了60 min為適萃取時(shí)間。 
　　 
　　2.4 白蟻碳?xì)浠衔锝M分及相對(duì)含量 
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，得到白蟻的表皮碳?xì)浠衔锏目傠x子圖(略)，采用峰面積歸一化法求出各組分的相對(duì)含量，應(yīng)用質(zhì)譜對(duì)各組分進(jìn)行定性分析，并與NIST譜庫(kù)對(duì)照，鑒定出25種化合物。從表1的結(jié)果可以看出中國(guó)臺(tái)灣乳白蟻表皮碳?xì)浠衔镏饕獮橐恍┩闊N和烯烴類(lèi)化合物，其鏈長(zhǎng)從C₉～C₂₀共有24中化合物，其中已11，13一二甲基二十六烷烴的含量高，為33，34；其次為2，4，6，一*基二十七烷烴含量為15.75％。結(jié)果表明SPME可以用于白蟻的表皮碳?xì)浠衔锓治觥?nbsp;
　　 
　　3　討論 
　　 
　　本研究中利用的固相微萃取(solid-phasemicroextraction，SPME)是20世紀(jì)90年代興起并迅速發(fā)展的新型的樣品前處理技術(shù)，無(wú)需有機(jī)溶劑，操作也很簡(jiǎn)便。該技術(shù)使用的是1支攜帶方便的萃取器，適于室內(nèi)使用和野外的現(xiàn)場(chǎng)取樣分析，也易于進(jìn)行自動(dòng)操作。這對(duì)樣品數(shù)量多、操作周期短的常規(guī)分析極為重要，不僅省時(shí)省力，而且對(duì)提高方法的度和重現(xiàn)性有重要意義。 
　　傳統(tǒng)的正己烷提取方法存在很多缺陷，如提取時(shí)間較難確定，時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致白蟻體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的溢出，嚴(yán)重影響GC—MS分析結(jié)果；時(shí)間較短會(huì)導(dǎo)致對(duì)白蟻表皮碳?xì)浠衔锍煞痔崛〔?，嚴(yán)重影響分析性，且操作方法較復(fù)雜。本研究中利用的SPME法能大大改善上述傳統(tǒng)提取方法的缺陷。具有較強(qiáng)的使用價(jià)值，在昆蟲(chóng)信息物質(zhì)提取分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種萃取頭中100 μmPDMS萃取頭對(duì)白蟻表皮碳?xì)浠衔镉泻玫妮腿⌒Ч?，且該種萃取頭的重復(fù)性好抗逆性強(qiáng)，每次實(shí)驗(yàn)后應(yīng)及時(shí)對(duì)萃取頭進(jìn)行高溫解析，以清除其吸附的雜質(zhì)，分析的。溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)定的3個(gè)溫度中6022為佳萃取溫度，溫度過(guò)高或過(guò)底均會(huì)影響其物質(zhì)的萃取。萃取時(shí)間試驗(yàn)表明，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)萃取物質(zhì)的量逐漸增加，但到達(dá)一定時(shí)間后萃取的物質(zhì)的量差異不顯著。 
　　Harverty等多年來(lái)對(duì)白蟻的表皮碳?xì)浠衔镞M(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)原白蟻屬Zootermopsis群體(包括各個(gè)等級(jí))的表皮碳?xì)湮镞M(jìn)行分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了63個(gè)組分。根據(jù)各組分的有無(wú)、含量及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，認(rèn)為原白蟻屬群體可分為4個(gè)*的碳?xì)湮锉憩F(xiàn)型，從而對(duì)Zootermopsis屬現(xiàn)存3個(gè)種的劃分提出質(zhì)疑，認(rèn)為如果表皮碳?xì)湮锞哂蟹N的特異性，那么Zooternwpsis應(yīng)該至少有1個(gè)新種。 
　　本實(shí)驗(yàn)的碳?xì)浠衔锓治鰷y(cè)定，發(fā)現(xiàn)了中國(guó)臺(tái)灣乳白蟻24種碳?xì)浠衔铮@些化合物主要是由一組從C₉～C₂₉。的烷烴或烯烴內(nèi)化合物組成，在白蟻表皮碳?xì)浠衔镏?1,13-二甲基二十六烷烴的含量高，2，4，6，-*基二十七烷烴的含量次之。實(shí)驗(yàn)中白蟻表皮碳?xì)浠衔锓治?，?yīng)盡量使用活蟲(chóng)，同時(shí)應(yīng)避免萃取時(shí)對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行過(guò)多的加熱，破壞其表皮碳?xì)浠衔锝M分。本實(shí)驗(yàn)為白蟻分類(lèi)提供了一種科學(xué)的方法。